贴壁细胞培养

简介

贴壁细胞（adherent cells），这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，如：培养（瓶）器皿壁上，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长，繁殖。细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始进行有丝分裂，并很快进入对数生长期。

当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞。贴壁细胞生长过程分为五个时期，分别是游离期、贴壁期、潜伏期、对数期、平台期和衰退期。

到货处理

细胞在常温放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况，如293T、LNCaP clone FGC 等。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  

收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

细胞复苏

冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。一般采用快速融化原则复苏细胞，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

1） 超净工作台使用前紫外线照射30分钟。使用前，后用75%酒精擦拭台面。保持台面干净整洁。使用时一定打开通风。

2） 将冻存细胞从-80度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分钟内）37℃ 恒温水浴中预热水浴锅中，不停晃动以化冻。

3） 立刻将化冻的细胞液转移进装有3 mL DMEM完全培养基的5 mL离心管中并吸打均匀。注意液体不要留在瓶口或瓶盖上，避免增加污染的可能。

4） 复苏细胞时，离心机提前降温至4℃，以 1000 rpm的转速将细胞悬液离心 5 分钟并弃上清。

5） 用 3 mL DMEM 完全培养基重悬细胞，并转移进T25细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中。

6） 在显微镜下观察复苏细胞的状态，并及时更换完全培养基。

7） 当细胞密度占显微镜视野 80%～90% 时，应进行细胞传代。

贴壁细胞传代

1） 弃置原培养瓶中的培养基，从培养瓶边缘加入 2 mL 预热的 PBS 平衡盐溶液润洗细胞（注意不要直接冲到细胞表面）。

2） 沿培养基侧壁加入1 mL 预热的 0.25% （w/v） Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆盖细胞表面。于细胞培养箱中孵育，孵育时间根据细胞的特点而定。

3） 向培养瓶中加入3-5 mL 完全培养基中和 Trypsin 的作用，并轻轻吸打细胞表层数次。将细胞悬液转移到15 mL离心管中，在室温下以 1000 rpm的转速将细胞悬液离心3分钟。

4） 小心弃去离心管中的上清液，使用 1mL 完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其完全被吹打为单个细胞状态，尽量减少泡沫的产生。

5） 进行细胞计数后以 1:3（1:2～1:6均可）的比例进行细胞传代。

6） 取三只T25细胞培养瓶，每只培养皿中加入5-8mL完全培养基，将细胞悬液平均分配至三只培养皿中，盖上盖子后，按照画十字的操作，将细胞摇匀。

7） 细胞培养皿放入细胞培养箱中，继续培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液。

贴壁细胞冻存

细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则，慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。

当温度低至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止，低于-130℃时，细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。

冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

1）预热冻存液；

2）用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化（此步骤同细胞传代操作）；

3）终止消化后，重悬细胞，转移至15 mL离心管，1000rpm离心5min；

4）弃上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5）分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

6）将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

7）将冻存管转移至液氮长期保存。