细胞培养

细胞培养

培养基，是指供给微生物、植物或动物 (或组织) 生长繁殖的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐 (包括微量元素) 、维生素和水等几大类物质。

培养基的作用

真核细胞培养基的作用是提供一个合适的生长环境，支持细胞的增殖、分化和维持其特性。培养基中的各种成分起到以下作用：

1、提供营养物质：包括氨基酸、糖类、维生素等，为细胞的基本代谢和生长提供所需的营养。

2、提供生长因子：包括各种生长因子、激素等，促进细胞的增殖和分化。

3、维持渗透平衡：通过矿物质和无机盐来维持细胞内外的渗透平衡，确保细胞的正常功能。

4、支持细胞附着和生长：通过添加胶原蛋白等成分，促进细胞在培养器皿上的附着和生长。

5、预防污染：通过添加抗生素和抗真菌剂来防止培养基受到细菌和真菌的污染。

细胞培养基的理化性质

1、缓冲能力

细胞培养过程中造成细胞培养液 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2。在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH很快下降；打开培养器具时CO2溢出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，按照以下化学反应方程式调节细胞培养基的pH值：H2O+ CO2 → H2CO3⇌ H+ + HCO3-NaHCO3⇌ Na+ + HCO3  另外，还有缓冲能力较高的磷酸盐缓冲系统。但碳酸盐缓冲系统的细胞毒性小、成本低，在细胞培养中应用得更为广泛。另一种较为常用的缓冲液是HEPES液，它是一种非离子两性缓冲液，在pH 7.0~ 7.2范围内有比较好的缓冲能力。 细胞培养时HEPES的添加浓度一般为10∼25mmol/L,注意高浓度的HEPES可能对细胞有毒性作用。

2、温度

温度对细胞培养基影响较大，温度过高可引起营养成份的降解或破坏，细胞培养基的pH、离子强度和电解常数pKa也可能会受到影响。如细胞培养液中的谷氨酰胺，在高温条件下降解的速度较快，如35℃贮存时，放置3天会降解25%左右，在4℃贮存3周会降解20%左右。

3、pH

动物细胞大多数需要pH在7.2∼7.4之间。细胞培养基的pH值通常需经校正的pH计来测定。在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳会被释放，培养液变酸，pH值发生变化。酚红是细胞培养基中最常用的pH指示剂，但依靠细胞培养基中的酚红等pH指示剂进行判断，存在较大的主观性。个性化细胞培养基或是无血清细胞培养基中酚红含量较少或是不含酚红，可通过pH计或者pH电极进行pH值的检测，结果更准确可靠。

4、表面张力与粘滞性

含血清细胞培养液的粘滞性主要是由血清引起的，在转瓶培养贴壁细胞时，培养液的粘滞性对细胞生长没有多大影响；但在生物反应器悬浮培养细胞时，细胞培养液的粘滞性则直接影响搅拌转速控制及搅拌剪切力对细胞造成的损伤程度。表面张力对细胞培养有较大的作用，尤其在利用生物反应器进行悬浮培养时，搅拌和通气都会引起泡沫的产生。对于含血清培养液，由于血清中多种蛋白的存在，搅拌时产生的气泡较多，气泡的上升运动对细胞的损伤程度还有争议，但气泡的破裂对细胞有明显的损伤作用。为降低这种损伤，可通过在细胞培养基中添加保护剂，降低细胞-气体和细胞-液体的表面张力，减少气泡的形成。

5、渗透压

细胞必须生活在等渗环境，大多数体外培养的细胞对渗透压有一定耐受性。对于大多数哺乳类动物细胞,渗透压在260∼320mmol/kg(毫摩尔/千克)的范围内都适宜。在生产、配制细胞培养基的过程中，渗透压的测定较为重要，有助于防止在生产、配制过程中出现称量等方面的错误。反应器高密度培养动物细胞过程，在添加碳酸氢钠的过程中注意渗透压的监控，防止渗透压过高对细胞的损害。

完全培养基中各物质的作用

1、双抗

青霉素-链霉素混合液，也被称为“双抗”，是体外培养中为预防微生物污染最常用的抗生素。

1.青霉素(Penicillin)最初从真菌青霉菌中纯化制成，其作用机制为直接干扰细菌细胞壁的转换以及通过触发可进一步改变细胞壁的酶释放间接干扰细菌细胞壁的转换。能够干扰细菌细胞壁的合成，对革兰氏阳性菌特别有效。

2.链霉素(Streptomycin)起初是从灰色链霉菌中纯化制成。能够与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效，但对革兰氏阴性菌特别有效；青霉素溶液对温度和酸碱度较为敏感，室温易降解,PH6.0∼6.5时最为稳定;链霉素则相对稳定,PH5.0∼7.5时最为稳定。

2、胎牛血清

胎牛血清是细胞培养基中最广泛使用的生长补充剂，因为它具有高含量的胚胎生长促进因子。当以适当的浓度使用时，它提供许多已定义和未定义的成分，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些成分已被证明可满足细胞培养的特定代谢需求。

1）提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物；

2）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力;

3）部分些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用；

4）是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需的因子来源；

5）起酸碱度缓冲液作用；

6）提供蛋白酶抑制剂，能在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

各种因子

1、L-谷氨酰胺(L-Glutamine):是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而变。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

2、GLutaMAX:即谷丙氨酸二肽,部分培养基中会使用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽来代L-谷氨酰胺，此二肽在水溶液中极为稳定，可以在储存、孵育和长期培养过程中防止L-谷氨酰胺的降解和氨的积累。

3、丙酮酸钠：丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

4、HEPES: HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)是一种常用的两性离子缓冲液，在下的pKa为7.3。由于培养中细胞的生长和代谢会导致培养基的环境pH值发生剧烈变化，因此，为了维持可以稳定培养细胞的环境，通常，大多数细胞的最佳培养环境是pH7.2-7.4,HEPES的缓冲范围恰好在pH6.8-8.2内，这对于细胞培养是有利的。与其他缓冲液(例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)和TRIS)相比，HEPES在维持细胞培养基的pH值方面具有更高的稳定性。

5、酚红：酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂，用以持续监测培养液的酸碱度，在低PH值时酚红使培养液呈黄色，而较高的PH值时使培养液呈紫色，PH值7.2∼7.4时为红色，最适合细胞培养。但酚红也有一些缺点，研究表明酚红可以模拟固醇类激素(特别是雌激素)的作用，因此在用到雌激素敏感的细胞时(如乳腺组织)，最好使用不含酚红的培养基。酚红会干扰流式细胞分析时候的检测。此外，一些无血清培养基的配方中若存在酚红会干扰钠-钾平衡。

6、生长因子：包括各种生长因子、激素和蛋白质，促进细胞增殖、分化和生存。

7、抗生素和抗真菌剂：用于防止培养基受到细菌和真菌的污染。

细胞培养基的种类

细胞培养基的发展历史，细胞培养基大致可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、限定化学成分细胞培养基等几大种类。

1、平衡盐溶液

主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。其主要用于细胞的漂洗、配制其他试剂等。

2、天然细胞培养基

天然培养基指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，但缺点是成分复杂，来源受限且制作过程复杂、批间差异大。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

3、合成细胞培养基

合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。最早开发的基础培养基(minimal essential medium,MEM)，其本质为含有盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗混合物。在此基础上, DMEM、 IMDM、 HAMF12、 PRMI1640等各种合成细胞培养基被不断开发出来。与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用合成培养基时必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的做法是添加5~10%的血清，这样才能维持细胞活力，促进细胞增殖。针对不同的动物细胞，现已开发了多种商业化、个性化的低血清细胞培养基配方，营养成份更加丰富，血清使用量可降低至1~3%，由此可减少了血清等动物来源成份对生物制品安全性的影响。

4、无血清细胞培养基

经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基，一般是在合成培养基的基础上，加入成份完全明确的或部分明确的血清替代成份，达到既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用血清所带来问题的目的。

无血清培养基中通常需要添加一些额外的组分，才能帮助细胞贴壁生长，包括以下几大类物质：

1）促贴壁物质：一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。

2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。

3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中需含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。

4）结合蛋白和转运蛋白： 常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

5）微量元素： 硒是最常见的。

5、无蛋白无血清细胞培养基与化学组份限定无血清细胞培养基

1）无蛋白无血清细胞培养基(protein freemidium,PFM)

这类培养基完全不含有动物来源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及类固醇激素和脂类前体等，以替代动物激素、生长因子的作用。其特点是完全没有蛋白或蛋白含量极低，有利于生物制品的分离纯化。

2）化学组份限定无血清细胞培养基(Chemicallydefined media, CDM)

此类培养基是目前最安全、最为理想的无血清细胞培养基，所有成份的浓度都完全明确，即使其所添加的少量蛋白，也是可经过纯化处理，成份明确、浓度确定的蛋白。这类培养基较为理想地减少了生产的可变性，提高了生产工艺的重复性，并有效降低了纯化成本。

6、个性化细胞培养基

严格意义上来说，个性化细胞培养基不在细胞培养基的传统分类之列，其具体是指一类根据细胞特性、细胞培养工艺特点、使用者需求习惯而量身定制的细胞培养基，主要目的是提高细胞产率、产品质量、产品安全性和降低血清的使用等。个性化细胞培养基可能是无血清培养基，也可能是低血清培养基，最终是为满足某一种或某一类生物制品的生产需求。

各种基础培养基

1、RPMI-1640 Medium

RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。

2、Minimum Essential Medium (MEM)

也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。

3、DMEM (标准型)

DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基，是在MEM细胞培养基的基础上研制的。DMEM分为高糖型(高于4500 mg/L) 和低糖型(低于1000mg/L)。

高糖型具有利于细胞贴壁，适于生长较快、高密度培养等优点，适用于多种哺乳动物细胞培养，包括成纤维细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞,以及293、Cos-7和PC-12等细胞系。

低糖型更适合代谢作用较慢、葡萄糖需求低的细胞的培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。

4、DMEM/F12

DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合, 称为DMEM/F12培养基 (DMEM/F12medium) ，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。

5.IMDM培养基

IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培养基是营养成份含量极丰富的合成培养基，用于高密度细胞的快速增殖培养。IMDM培养基是DMEM的改进型，其中含有其他氨基酸、维生素、硒和 HEPES 缓冲剂，并使用硝酸钾代替硝酸铁。 不含α-硫代甘油和β-巯基乙醇，培养特定细胞时可能需要添加白蛋白和转铁蛋白或胰岛素。

6.M199培养基

M199培养基常用于疫苗生产、病毒学以及多种非转化细胞的培养。

7.L-15培养基

L-15培养基的配方中不含用于 CO2 平衡环境的碳酸盐缓冲系统，而是用磷酸盐、L-精氨酸、L-组氨酸和L-半胱氨酸作为缓冲剂。用半乳糖和丙酮酸钠代替葡萄糖以防止乳酸的形成。用于猴肾细胞及来源于胚胎或组织的原代细胞的增殖。

用此种培养基培养的细胞培养时候需要的气相条件为:100%空气

8.McCoy's 5A培养基

McCoy's5 A培养基是一种用途广泛的基础培养基，用于多种原代细胞及细胞系的培养，如来源于骨髓、皮肤、脾脏、肾脏、肺等组织的原代哺乳动物细胞。

9.MCDB培养基

此种培养基比较少见。其含有微量元素、腐胺、腺嘌呤、胸腺嘧啶以及更高浓度的氨基酸和维生素，在使用时常与EGF、氢化可的松、谷氨酰胺以及低浓度血清搭配使用，血清的添加浓度须根据细胞类型而定。