细胞增殖侵袭及活性检测

细胞增殖侵袭及活性检测

背景

细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下，通过复制、转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂过程。其中核DNA的复制倍增是整个过程的重要特征。细胞实验中原代细胞和肿瘤细胞株均有增殖能力，为检测研究的药物或者基因的变化对细胞的增殖的影响，一般会使用CCK-8细胞检测、平板克隆实验检测、肿瘤成球实验、EdU染色等实验。

原理

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。试剂盒中的水溶性四唑盐 WST-8 是 CCK-8 的主要成分，粉色，可以直接加入细胞中，在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜类染料（Formazan），并释放到细胞外溶解在培养基中，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

步骤

CCK8检测细胞增殖

1. 细胞悬液制备：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入约1×10³-2×10³个细胞/100ul（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）；

2. 接种细胞悬液：在96孔板接种细胞悬液，可做多个实验组，每组设置4-6个复孔，同时设置空白组，然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养12-24 h；

3. 加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10% CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入，将加完CCK-8的培养板放入37°C 5% CO2 培养箱中孵育0.5-4h；

4. 测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。阴性对照孔OD值在0.18-0.40之间，阳性对照孔最大在1.8-2.2之间最佳。

细胞毒性检测

1. 细胞悬液制备：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，每孔加入5×10³个细胞/100ul ；

2. 接种细胞悬液：在96孔板接种细胞悬液，每组设置4-6个复孔；

3. 将培养板置于培养箱中预培养（37℃，5% CO2）12-24小时，使细胞达到指数期（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）；

4. 加药及加药后孵育时间：观察细胞贴壁良好，吸出各孔培养基，实验组加入含不同浓度药物的培养基，空白组加入不含药物培养基，然后将96孔板在37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中孵育适当时间，根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间；

5. 加入CCK-8：配置成含10% CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。加入CCK-8后孵育时间：将加完CCK-8的培养板放入37°C  5%CO2 培养箱中孵育0.5-4h；细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样，如果显色不够的话，可以继续培养，特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）；

测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。

计算公式

细胞活力（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

细胞抑制率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)；

Ac: 对照组吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物)；

Ab: 空白组吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物)。

注：细胞活力指细胞增殖活力或细胞毒性活力。

注意事项

1.做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

2.接种时注意细胞悬液一定要混匀，避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致，可以多做几个复孔。

3.培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基或PBS。

4.CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。

5.若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。

6.混合或重悬组分时，避免产生气泡，因为它们会影响OD值读取。

7.加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。

8.加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。

9.边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响。

10.由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。