细胞永生化

细胞永生化

背景

衰老死亡是一种正常的不可逆的细胞生理过程，正常组织来源的原代细胞在通常的体外培养条件下可分裂生长，但细胞在不断增殖分裂的过程中会达到衰老M1期和致死M2期，细胞会停止分裂并启动凋亡过程。此时如果细胞在某些原因诱导下，恢复基因的稳定性，则可以逃离衰老死亡的正常生理过程达到无限增殖分裂的永生化状态。利用基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，从而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的。

意义

1.癌症研究：许多癌症细胞表现出永生化的特征，使它们能够持续分裂并逃避正常的细胞控制。靶向这些机制可能为开发癌症疗法提供新的途径，因为抑制癌症细胞无限增殖的能力是一种潜在的治疗策略。

2.衰老和衰老：由于端粒缩短和细胞周期中的检查点等因素，正常体细胞的复制能力有限了解细胞是如何永生的，可以揭示嘉老过程和细胞寿命的限制。

3.干细胞生物学：通过研究导致细胞永生化的因素，研究人员可以深入了解干细胞增殖和分化的调控。永生细胞系是研究干细胞在再生医学中潜力的宝贵工具。

4.生物医学研究和药物开发：永生细胞系是生物医学研究的基本工具。它们为研究细胞过程、药物反应和毒性提供了一个稳定且可重复的平台。无限期培养细胞的能力有助于长期实验，并使研究人员能够生成一致的数据。

方法

哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化。其中猿猴病毒40（SV40）T抗原和hTERT病毒诱导的细胞永生化最为简单可靠，应用广泛。

一、病毒转染

1、EB病毒

EB病毒( epstein-barr virus) 在体外能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。

目前，EB病毒感染细胞使其永生应用最多的是B淋巴细胞，可以直接用与EB病毒共培养的方法，而在其他细胞中的应用很少。

2、SV40病毒

SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。

近年，人们已成功获得多种SV40转化的永生细胞株，应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。

3、其它病毒

一些病毒如乳头瘤病毒E6、乙型肝炎病毒（HBV）虽不是使细胞永生的常用病毒，但它们可以使一些特殊细胞的增殖能力加强。人乳头瘤病毒E6蛋白是最常见的转化蛋白，通过对端粒酶催化亚基(hTERT)的转录调控而激活端粒酶。

二、端粒酶

端粒酶是由N和蛋白质组成的复合体，为一种特殊的DNA聚合酶，合成DNA到染色体末端，因而被认为是一种依赖自身RNA的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中，端粒长度逐渐缩短，细胞克隆将面临增殖危机和死亡，但这种细胞的端粒酶一旦被激活，将维持端粒缩短和延长的动态平衡，从而使细胞获得无限增殖的能力，使之永生或癌变。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活化可能是细胞永生化的共同步骤，病毒的转化能使一些细胞(如成纤维细胞、胚肾细胞等) 越过M1阻断，但并不能使细胞顺利的度过M2期。在许多转化细胞和肿瘤细胞中端粒长度近于临界值，所以推测端粒酶活化可能是细胞永生化过程中较晚的事件。

研究细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端粒酶催化亚基( hTERT )的表达载体，通过各种方法来转染细胞。

三、放射因素

通过X射线、电离辐射、60Co 等放射性因素进行细胞永生化的方法，可使细胞周期得到延伸。可能是由于放射因素破坏了细胞的衰老机制，或促进了与细胞永生相关基因的表达。

四、癌基因、原癌基因

根据细胞凋亡与增殖的机理，有人用c-myC、c-fos、Ras等原癌基因转染细胞，使抑癌基因突变功能丧失，从而使细胞永生。转染c-myc基因到人正常乳腺上皮细胞，可恢复端粒酶活性，并使p53发生突变，进而促进细胞永生化。但也有一些癌基因不仅不能转化细胞，甚至促'进细胞的衰老，如Ras癌基因、Ab5等。