原代细胞培养

原代细胞培养

简介

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA）处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

流程

原代细胞的获取

原代细胞的获取，就是从活体上将组织分解成单个细胞再进行培养的过程，且整个过程要求无菌操作。具体要考虑的问题有：组织分解的方式，培养的时间，换液时间，细胞状态判断和冻存。

将组织分解成单个细胞的方式目前主要有两种：酶消化法和组织块法（针对贴壁细胞）。

酶消化法：所用试剂：胶原酶和胰酶。

胶原酶的选择：（根据自己的组织样本选择合适的胶原酶）

类型                           适用组织

胶原酶Ⅰ 上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离.

胶原酶Ⅱ 软骨，肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离。

胶原酶Ⅲ 消化组织中连接部分使其成为单个细胞，解离哺乳动物组织细胞

胶原酶Ⅳ 多种组织。

胶原酶Ⅴ 胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

胶原酶消化时间：根据组织特性，消化时间会有差异。以小鼠肾细胞为例，加入胶原酶Ⅰ进行消化后，放入37℃培养箱中消化45min~1h左右，期间每隔10min中震荡一次，知道组织块几乎完全消失为止（若是组织块剪得非常细小，时间可以短一些，30min左右即可）。

培养过程：

注意原代细胞在培养2天后可能会出现细胞液变黄（橘黄色）的现象，且无漂浮物，这是正常现象，不是污染。这是由于细胞在贴壁生长过程中释放了二氧化碳和其他物质导致培养液PH发生了改变，所以变黄。

组织块法

1、组织块培养法

1)用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2)用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；

3)将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；

4)将种植了组织块的一侧朝上，静置于 37℃培养箱中;待组织块贴壁 1h 到 3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；

5)每隔 2 到 3 天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。

注意事项

1)刚接种后，组织块粘附不牢固，观察和转移过程中动作要轻，以防引起液体振荡，使组织块漂起

2)培养初期，要注意观察有无细菌、霉菌污染

3)原代培养要及时观察，记录

4)过3-5天，需要换液以除去漂浮组织块和残留的血细胞，保证原代细胞正常生长

培养时间

无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以上的时间，期间可换液或者传代。

换液时间

无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。

细胞状态判断

正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。

细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代，传代一次后的细胞会更干净漂亮。

冻存

传一代后的细胞（也可以不传代直接冻存）培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。

原代细胞的培养

原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。

培养液选择

原代细胞培养基由补充了适当的生长因子和细胞因子的基础培养基组成。细胞在细胞培养箱中生长并维持在适当的温度和混合气体中（对于哺乳动物细胞，通常为37°C，5％CO2）。培养条件根据细胞类型而广泛变化。生长培养基的pH，葡萄糖浓度，生长因子和其他营养物质的存在可能会有所不同，具体取决于细胞类型。在建立原代培养过程中，必须在生长培养基中加入抗生素以抑制从宿主组织引入的污染。抗生素可能包括庆大霉素，青霉素，链霉素和两性霉素B的混合物。但是，不建议长期使用抗生素，因为某些试剂（例如两性霉素B）从长期来看可能对细胞有毒。

最常用的L/H DMEM，F12 DMEM，RPMI 1640。

细胞鉴定

有时候我们获取的原代细胞可能会有不是自己期望的细胞在里面，或者获取的不是我们的目标细胞。这个时候我们需要进行细胞的鉴定。细胞鉴定需要购买特定细胞的表面标志物抗体或者染色试剂进行鉴定。

原代细胞的应用

原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。在这些应用中几乎都涉及了几个最常见的且最基础的细胞实验，如下：

细胞增殖检测

常见检测方法：CCK8检测法 ，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成

细胞周期检测

常见检测方法：流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法

细胞凋亡检测

常见检测方法：流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色，电镜，TUNEL

细胞转移能力检测

常见检测方法：细胞划痕实验，Transwell实验，Invasion实验

贴壁型细胞培养

基本操作过程

1)首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。

2)低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。

3)根据培养的细胞类型和实验要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。

4)将培养瓶放入 37℃恒温箱中培养。

5)每隔 2 到 3 天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。

注意事项

1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的， 而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质， 使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低， 细胞之间的促生长作用很小， 虽然营养物质很充足， 也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。 如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足， 代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2)原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。适当增大原代培养接种的细胞密度， 给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用， 会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3)由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。 对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养 3h 到 5h，由于细胞悬液中带有少量培养液， 细胞即可以维持存活， 又可以很快接触到培养瓶底壁， 是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

悬浮型细胞培养

操作过程

1)制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。

2)在培养皿中加入足够的培养液。

3)将欲接种的细胞接种到培养器皿中。

4)在培养皿内放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送入恒温箱内。在磁力搅拌器上边搅拌边培养。若接种培养瓶或试管中，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒。有些细胞也可以不用磁棒或磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂包被的培养器皿内直接在培养箱中静置培养即可。

5)培养液略呈黄色换液。吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。

注意事项

1)进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以 5ml 为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快， 否则即可使培养液溢出又容易造成污染。 如果培养液的量在 5ml 以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2)能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。