实时荧光定量PCR检测

　　浏览量：　　发布时间：2023-03-14

实时荧光定量PCR检测

简介

Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

类型

1、SYBR Green Ⅰ染料法

原理：在PCR反应体系中加入荧光染料，DNA扩增过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链发射荧光信号，随着反应的进行荧光强度逐渐增强，从而实现实时测量。

优点：

（1）成本较低，适合样本数较多的实验。

（2）在实验设计阶段较省时，只需设计配对的引物。

2、TaqMan探针法

原理：在探针的5’端设计有报告基团，3’端设计有淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。

优点：

（1）引物和探针的结合特异性更高，数据更可靠。

（2）数据分析较为简便。

步骤

1、样本准备

从待测样本中提取DNA或RNA。

2、引物和探针设计

在 NCBI数据库中找到目标基因的序列以及位点，用primer primer 5或其他软件设计适当的引物和探针，用于特异性的扩增目标序列。一般在设计引物时，GC含量控制在40%-75%之间，引物的TM值比探针的小5-10℃。

3、PCR反应

将样本与引、探针一起加入带有DNA聚合酶的反应体系中，进行PCR扩增。PCR反应温度循环包括三个阶段：变性、退火、延申。在变性阶段，DNA双链会通过高温变成两条单链。退火时，引物、探针与目标序列互补配对。延申时，DNA聚合酶会合成新的DNA双链，此时，也会将与目标序列上互补配对的探针打掉，使探针上的荧光基团与猝灭基团分开，释放出荧光信号。

4、荧光信号检测

在PCR反应过程中，实时荧光检测仪会定期检测PCR管中的荧光信号。

5、数据分析

通过实时荧光收集到的信号，仪器会自动绘制荧光曲线，通常5-15个循环的荧光信号都属于背景信号，然后将其设置为扩增曲线的背景或基线。在理想条件下，PCR产物量呈指数倍增长Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循环次数，Yn：第n次循环后的产物量）。但实际上可能引物模板引物消耗完，DNA聚合酶逐渐失活等原因，产物量就恒定。荧光强度就呈“S型”曲线即“扩增曲线（Amplication plot）”，分为四个时期：基线期、指数扩增期、线性增长期、平台期。再根据待测样品的Ct，可计算样品拷贝数/浓度。通常模板每稀释10倍，CT值增大3.33。如果研究基因表达量通过比较达到设定荧光阈值所需的Ct值大小，可以比较出基因表达量的高低。