ELISA检测

ELISA检测

原理

ELISA检测的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

类型

ELISA直接法

在ELISA直接法中，样品中的抗原或抗体以非特异性方式直接吸附在包被板上。然后，将特异性测定抗体或抗原连接到孔中。之后，测定底物被用来产生可测量的颜色变化，并在读板器上进行量化。

由于这种检测方法步骤少，速度快，而且比其他ELISA方法更少有机会引入错误。然而，由于吸附步骤是非特异性的，背景噪音可能很高。没有二级抗体步骤意味着没有信号放大，降低了检测灵敏度。它还需要为每个所需目标创建共轭测定抗体/抗原。

ELISA间接法

ELISA间接法，或称iELISA，最初于1978年开发，用于检测人血清白蛋白，其工作方式与ELISA直接法非常相似，只是增加了一个二级抗体步骤。这使得测试信号得到放大，克服了ELISA直接法的局限性。

它还否定了对目标特异性共轭测定抗体/抗原的需要，因为共轭的二级抗体只需要对一级抗体具有物种特异性。如果总的样品抗原被结合到包被板上，就像ELISA直接法一样，背景噪音仍然是一个问题。

然而，如果该检测方法用于检测样品抗体，纯化的目标抗原被涂在板上，而一级抗体来自于样品。这大大减少了背景噪音，因此这些检测方法在确定样品中的抗体滴度时最受欢迎。

ELISA间接法的缺点包括方案时间较长，有更多出错机会，以及可能与二级抗体产生交叉反应。

夹心法

顾名思义，ELISA夹心法将抗原夹在抗体之间，该技术开发于1977年，可以采用ELISA直接或间接法的形式（上面描述的ELISA夹心法是基于ELISA间接法），除了抗原与检测板的非特异性结合，捕获抗体使其成为一个特异性的过程。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性。

然而，它们确实需要确定兼容的捕获和测定抗体对才能有效地发挥作用，而且可能有交叉反应的问题。这种检测方法通常也有最多的步骤，提供了更大的出错机会。由于抗原结合步骤的选择性，ELISA夹心法在抗原处于复杂混合状态时特别有用，因为不需要纯化抗原。

ELISA竞争法

ELISA竞争法，也被称为ELISA抑制法或ELISA阻断法，可能是ELISA技术中最复杂的一种。

最初是在1976年为检测人类绒毛膜促性腺激素而开发的，该检测方法通过检测对预期输出信号水平的干扰，产生一个反比关系。应用的样品中目标物越多，测定的输出信号就越低。

其他ELISA方法也可以被改变为竞争法。这里有两个一般的原则：样品抗原或抗体与参照物竞争，分别与有限数量的标记抗体或抗原结合；又或者，样品抗原或抗体可以与标记参照物竞争，分别与有限数量的抗体或抗原结合。

ELISA竞争法与它所采用的形式一样，具有一些相同的优点和缺点。然而，当抗原较小，限制了两个抗体同时结合的能力（如ELISA夹心法所要求的），或者只有一个抗体可用时，它的作用就凸显了出来

样品要求

1.检测样本为细胞培养上清、人和动物的血清、血浆等。样品收集后应立即-20℃保存，若长时间储存应-80℃保存。

注：样本收集后，立即按要求保存，切忌反复冻融。长途运输需要干冰运输。

2.样本量：若一个指标做复孔检测应不少于250 ul，做单孔检测应不少于120ul。

3.ELISA检测试剂盒。

4.提供实验相关的文献资料。