支原体检测

支原体检测

背景

支原体因为个头小，能穿过0.22um滤器，并且在实验室内会潜在的扩散。在细胞培养过程中，支原体污染率达到60%以上，是细胞培养中令人头疼的大问题。支原体污染的来源主要是以下几个方面：1)细胞之间交叉污染；2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；3)工作环境或实验器材的污染；4)培养基的污染。当细胞(特别是传代细胞)被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，污染严重时细胞生长缓慢，细胞形态发生改变，并出现细胞病变，且支原体感染不易察觉，由于支原体本身的特性，不易被清除，会导致实验研究中资金和人力的极大损失。

支原体污染细胞后，培养液不一定会发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。因支原体感染会使培养的细胞慢慢枯萎，使得用被污染的细胞样本做的实验完全失去意义和价值。因此，有必要对新引进的细胞和实验过程中的细胞株进行支原体检测。

检测方法

l培养法   

直接将待测样品涂布在支原体液体或固体培养基上，让其生长，一般需要数周，才能看到菌液变浑浊或有菌落长出。培养法是支原体检测最经典的方法，其优点是：灵敏度适中和结果可靠。但是培养法的一个主要缺点是时间周期太长，不适合作为细胞污染的快速检测方法。

lDNA的荧光染色法 

荧光染剂可以结合到细胞和支原体的DNA。被支原体污染的细胞经染色后，如果在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体的DNA，则证明有支原体之污染。该法相对培养法快速，但是灵敏度较差。当用荧光染色法发现有支原体后，支原体的清除相对困难。

l扫描电镜法   

将细胞样品进行扫描电镜拍照，如果被支原体污染可以在细胞表面看到密密麻麻的小颗粒。该方法由于要使用电子显微镜，不适合用作实验室常规检测。

lPCR法   

PCR法相对较快，灵敏度也较高，是目前实验室最常用的支原体检测方法。采用PCR法对目的细胞进行支原体等检测，是根据支原体核糖体16S-23S的rRNA的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断。

PCR法检测原理及步骤

原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的DNA序列在支原体各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。因此针对编码16S和23S rRNA 的 DNA 上设计一对F1/R1引物,扩增编码16S 和 23S rRNA 的 DNA 间隔区。此反应体系只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性都很高。

步骤：

1、细胞样品前处理，推荐样品制备方案：取500μl 细胞上清液（或上述细胞悬浮液），14000rpm离心5min，去除上清收集沉淀，再加入50μl无菌水，振荡混匀，95℃水浴10min后轻微振荡混匀，快速离心取上清以备用。

2、使用上述制备的样本作为模板，配制PCR扩增体系。

3、将反应管放入PCR仪中启动扩增，产物进行琼脂糖电泳检测。