流式分选

流式分选

简介

流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能对复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。

原理

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的，当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 

步骤

1、样品制备

制备细胞群离体样品时，通常要用机械分离方法轻柔匀浆化新切组织，并通过密度梯度离心法分离不同类型细胞，以便去除细胞外基质、碎片和无关细胞群。需要特别注意的是，在使用前，贴壁细胞必须先用酶液或钙螯合剂与吸附的细胞培养容器解离。悬浮细胞可直接进行计数和活力检测。细胞数/滴度特指悬液中的活细胞数量，可使用自动细胞计数仪，经设门排除死细胞/碎片后进行测定。此外，也可通过对已知体积的活细胞进行显微镜辅助计数从而检测细胞活力。

2、封闭

为防止一抗与悬液细胞非特异性结合，需要使用抗Fc抗体稀释液（特异性针对样本种属），防止抗体的Fc片段或恒定区与大多数细胞类型上都存在的Fc受体结合。通常取少量Fc封闭液加入洗涤后细胞进行封闭孵育。完成后无需洗涤，立即加入染色抗体稀释液，确保非特异性抗体结合的封闭效果持续存在。

3、抗体孵育

一抗孵育不同于其他基于抗体的应用（如免疫组化分析），流式细胞分析的抗体稀释度计算通常并不基于单位体积缓冲液所需的抗体用量，而是基于样本中单位细胞数目所需的抗体用量。与其他应用一样，最佳稀释浓度必须通过实验测定。可使用流式细胞检测缓冲液稀释抗体。少量染色有助于提高抗体与悬液细胞的接触几率。孵育结束后，应使用染色或检测缓冲液洗涤细胞至少三次，以便去除所有未结合的一抗。

二抗孵育进行间接法检测时，一抗孵育后需再使用适当稀释的特异性针孵育一抗同型的二抗。在多色流式检测实验中，每种二抗都必须搭配波长或颜色明显不同的荧光染料，以便充分区分不同靶标信号。二抗孵育必须遮光保护光敏感性荧光染料，而样品应同之前一样应始终在冰上且在4°C下离心。

荧光染料流式细胞分析所用的抗体很多都会直接偶联荧光染料；不过，很多未标记一抗则通常与标记二抗联合使用。流式细胞分析最常用的两种荧光染料是异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)。

4、固定和储存

表面抗原染色完成后，如不急于重悬细胞进行检测，可立即用多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液）对细胞进行固定处理。样品染色后无法立即进行检测时，如此处理可在4°C下过夜储存细胞。之后，应稀释固定剂并至少洗涤细胞两次。

当目标抗原位于细胞内时，表面染色结束后必须固定细胞提高结构强度，使细胞能够抵抗后续需要执行的破膜操作（让抗体能接触到细胞内抗原）。完成固定和洗涤步骤的细胞破膜时，可采用适合的去垢剂（溶于磷酸盐缓冲液）室温孵育至多15分钟，之后稀释去垢剂溶液并洗涤细胞一次。

所有涉及抗体或链霉亲和素的步骤都必须持续维持破膜效果，因此需在荧光染料孵育及后续所有染色步骤的染色缓冲液中掺入去垢剂。

5、数据采集

现有大多数流式细胞仪都配有必要的软件，以便对每个细胞通过检测器时生成的颗粒特性信号进行采集和转化。首先是寻找目标细胞，随后调整仪器设置到合适的状态（需要设置阴性对照调整仪器PMT电压和单阳性对照调整仪器补偿），接下来设定阴性与阳性群体的界限，确定阳性与阴性细胞群体，并统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数等。

样品要求
1、分选样品：细胞需无菌，用含2%FBS，10%双抗的PBS悬浮，细胞浓度不少于1×10⁷/ml。
2、分析样品：500μl 4%的多聚甲醛固定避光一周以内检测，细胞总量不少于1×10⁴；不能固定的样品用含2%FBS的500μl PBS悬浮，12小时内检测。